Lily Tomlin ist die Tochter eines Fabrikarbeiters. Sie hat einen jüngeren Bruder namens Richard, der 1943 geboren wurde. Tomlin studierte Medizin an der Wayne State University, entdeckte jedoch früh ihr Interesse an der Schauspielerei und machte erste Bühnenerfahrungen als Stand-up-Comedian. 1966 arbeitete sie als Sekretärin für einen Casting Director beim Fernsehen und gelangte auf diesem Weg zu ihrem ersten TV-Auftritt als Entertainerin in der Gary Moore Show. Mit ihrer Verkörperung der Telefonistin Ernestine in der Fernsehserie Rowan and Martin's Laugh-In wurde Tomlin 1969 US-weit bekannt.